Nature子刊｜山大齊魯醫(yī)院張澄、張猛教授聯合山大基礎醫(yī)學院高成江教授揭示RNF128在動脈粥樣硬化中的關鍵角色
巨噬細胞來源的泡沫細胞形成是動脈粥樣硬化斑塊的標志，RNF128 作為一種膜定位的泛素連接酶，其在動脈粥樣硬化中的作用未知；SRB1在巨噬細胞中的作用存在爭議，且其泛素化修飾對oxLDL內吞的調控機制有待探索。2025年3月4日，山大齊魯醫(yī)院張澄、張猛教授聯合山大基礎醫(yī)學院高成江教授在Nature Communications?(IF 14.7)?發(fā)表文章“E3 ubiquitin ligase RNF128 promotes Lys63-linked polyubiquitination on SRB1 in macrophages and aggravates atherosclerosis”。研究發(fā)現RNF128可通過促進巨噬細胞中SRB1的K63連接的多聚泛素化加重動脈粥樣硬化，為動脈粥樣硬化的治療提供了潛在的新靶點。
敲除RNF128能減輕AAV-PCSK9誘導的小鼠動脈粥樣硬化
研究結果
1.巨噬細胞特異性缺失RNF128通過減少脂質攝取來減弱泡沫細胞的形成
研究發(fā)現在小鼠和人類的動脈粥樣硬化病變中，RNF128蛋白水平隨病變進展而升高，且受脂質積累驅動。通過siRNA沉默野生型小鼠巨噬細胞中RNF128基因，發(fā)現RNF128缺失的巨噬細胞在oxLDL存在下，泡沫細胞形成減少，細胞總膽固醇含量也低于對照組。構建巨噬細胞特異性RNF128 敲除小鼠（RNF128-CKO），該小鼠來源的巨噬細胞在oxLDL處理后，脂質積累減少。同時，過表達RNF128則促進野生型巨噬細胞脂質積累。攝取實驗及膽固醇流出檢測發(fā)現，RNF128主要通過調節(jié)脂質攝取促進泡沫細胞形成。構建缺乏RING結構域的RNF128催化失活突變體（Flag-RNF128 ΔR），發(fā)現過表達野生型RNF128可恢復RNF128-CKO小鼠巨噬細胞中減少的脂質積累，而Flag-RNF128 ΔR 則不能；且RNF128增強 oxLDL 攝取依賴于RING 結構域，說明巨噬細胞靶向缺失 RNF128 通過減少oxLDL攝取減弱脂質積累。進一步研究分析證明RNF128缺乏下調SRB1蛋白水平并影響泡沫細胞形成。
巨噬細胞特異性缺失RNF128通過減少脂質攝取來減弱泡沫細胞的形成
2.SRB1參與RNF128對泡沫細胞形成的影響
數據表明RNF128影響SRB1蛋白穩(wěn)定性，使用溶酶體功能抑制藥物處理 RNF128缺陷的巨噬細胞，SRB1蛋白水平的下降受到顯著阻止；而蛋白酶體抑制劑對SRB1表達無影響，說明RNF128通過抑制SRB1的溶酶體蛋白降解來上調其蛋白水平。進一步分析證實RNF128通過E3連接酶活性穩(wěn)定SRB1。在 RNF128基因敲除的巨噬細胞中過表達SRB1，發(fā)現其對Dil-oxLDL的攝取能力增強，脂質積累也得到恢復。CoIP實驗發(fā)現RNF128與SRB1蛋白存在相互作用，將RNF128截短為多個片段進行CoIP分析，發(fā)現除全長RNF128外，RNF128-ΔR、RNF128-N和RNF128-ΔC也能與SRB1相互作用，表明N端對結合至關重要。由于信號肽是蛋白轉運的重要組成部分，構建缺失PA結構域的RNF128突變體（RNF128-ΔPA）和僅含PA結構域的重組質粒（RNF128-PA），結果顯示RNF128因PA結構域缺失失去與SRB1的結合能力，而RNF128-PA可有效結合SRB1。通過探究RNF128 對SRB1的泛素化修飾作用，發(fā)現RNF128能催化SRB1在賴氨酸478位點的K63連接的多聚泛素化。此外，RNF128介導的SRB1泛素化促進其通過Rab11再循環(huán)到膜上。
RNF128通過PA結構域與SRB1蛋白的細胞外區(qū)域相互作用
3.巨噬細胞特異性缺失RNF128改善小鼠動脈粥樣硬化
最后，研究團隊研究了巨噬細胞特異性敲除RNF128對小鼠動脈粥樣硬化的影響。將 RNF128 條件性敲除小鼠（RNF128fl/flLyz2cre）與ApoE-/-小鼠雜交，構建動脈粥樣硬化模型。喂食西方飲食（WD）20 周后，發(fā)現敲除RNF128的ApoE-/-RNF128fl/flLyz2cre小鼠與對照組小鼠相比，動脈粥樣硬化病變面積顯著減小，主動脈根部病變面積在雄性和雌性小鼠中分別減少約 23% 和 32%。免疫熒光染色顯示，敲除RNF128可降低動脈粥樣硬化斑塊中SRB1的表達，免疫組化檢測發(fā)現斑塊內炎癥細胞因子 TNFα、IL1β 和 IL6 顯著減少，Masson染色表明敲除組小鼠斑塊中膠原蛋白含量增加，說明RNF128抑制不僅減緩動脈粥樣硬化發(fā)展，還使斑塊表型更穩(wěn)定。進一步將AAV-PCSK9 靜脈注射RNF128fl/flLyz2cre和RNF128fl/fl小鼠，構建LDLR缺陷小鼠模型。結果顯示在雄性和雌性小鼠中，敲除 RNF128 均能減輕動脈粥樣硬化，進一步驗證其抗動脈粥樣硬化作用。通過構建攜帶巨噬細胞特異性啟動子的 AAV，分別對ApoE-/-RNF128fl/fl小鼠和ApoE-/-RNF128fl/flLyz2cre小鼠進行處理。結果顯示，RNF128 缺陷可改善動脈粥樣硬化，而在ApoE-/-RNF128fl/flLyz2cre小鼠中給予巨噬細胞SRB1則促進主動脈和主動脈根部的斑塊形成，表明SRB1是RNF128促動脈粥樣硬化作用所必需的。
巨噬細胞特異性缺RNF128可改善小鼠動脈粥樣硬化
研究結論
本研究揭示了RNF128在泡沫細胞形成中的作用，且其在小鼠和人類中與動脈粥樣硬化的正相關關系。巨噬細胞特異性敲除RNF128的ApoE-/-小鼠，其動脈粥樣硬化的發(fā)展在雄性和雌性中均得到改善；在由PCSK9誘導的LDLR缺陷小鼠中也觀察到了相似現象。機制上，首次發(fā)現了RNF128與SRB1之間的直接相互作用，RNF128促進SRB1在賴氨酸478位點發(fā)生Lys63（K63）連接的泛素化，這促進了Rab11介導的SRB1向細胞膜的回收，并促進了oxLDL的內吞過程。因此，巨噬細胞會積累脂質并加劇炎癥，進而形成泡沫細胞。因此對巨噬細胞RNF128進行適當干預具有潛在的治療意義。
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