瘋狂打call的甲亢造模工具—重組腺病毒Ad-TSHR289，了解一下！
甲亢是一種常見的器官特異性自身免疫性疾病，是由于甲狀腺合成釋放過多的甲狀腺激素，造成機體代謝亢進和交感神經(jīng)興奮。甲亢病因很多，與情緒，碘營養(yǎng)，自身免疫，家族遺傳性都有關(guān)系，常見的有彌漫性毒性甲狀腺腫（又稱Graves’ disease，GD）、炎性甲亢、藥物致甲亢、HCG相關(guān)性甲亢和垂體TSH瘤甲亢，其中以Graves甲亢最為常見，約占所有甲亢的60%~80% 。
Graves甲亢每年發(fā)病率約為萬分之四，其發(fā)病關(guān)鍵是在環(huán)境與遺傳因素的相互作用下，機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了針對促甲狀腺激素受體 (TSHR) 的自身抗體（TSAb），TSAb與TSHR的結(jié)合激活下游信號級聯(lián)反應(yīng)，模仿TSH持續(xù)刺激的效果，從而導(dǎo)致甲狀腺功能亢進，若不及時治療，會導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率。此外，Graves甲亢相關(guān)眼病折磨著大約50%的患者，尤其難以治療。
1、促甲狀腺激素受體（TSHR）
TSHR是一種細胞表面糖蛋白受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族成員，由764個氨基酸組成，分子量為87kDa。人類TSHR編碼基因位于14號染色體長臂(14q31)，基因共含10個外顯子，前九個外顯子編碼胞外龐大的N-端區(qū)，該胞外區(qū)包含一個富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，通過鉸鏈區(qū)與跨膜結(jié)構(gòu)域相連；第十個外顯子則編碼七個跨膜片段以及胞內(nèi)短小的C-末端。不同于其他糖蛋白激素受體，TSHR胞外結(jié)構(gòu)域中插入了一個包含50個氨基酸的序列（C肽），在翻譯后修飾過程中，金屬蛋白酶介導(dǎo)的分子內(nèi)裂解作用使TSHR的N-端胞外結(jié)構(gòu)域與跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域分離，C肽序列被移除，使TSHR轉(zhuǎn)化為通過二硫鍵連接的A亞基（289aa）和B亞基。
TSHR基因組結(jié)構(gòu)示意圖
TSHR蛋白結(jié)構(gòu)示意圖
2、TSHR自身抗體（TRAb）
TRAb是一種甲狀腺自身抗體，能特異性地針對甲狀腺細胞膜表面的TSHR。根據(jù)生理學(xué)作用的不同，可將TRAb分為甲狀腺刺激性抗體（TSAb）及甲狀腺刺激阻斷抗體（TBAb）。TSAb存在于Graves病患者的血清中，與TSHR結(jié)合產(chǎn)生類似TSH的生物效應(yīng)，刺激甲狀腺發(fā)生甲亢，是目前GD的首選篩查方法；TBAb存在于自身免疫甲狀腺炎甲減患者，可以與TSHR結(jié)合，阻斷TSH的作用，發(fā)生甲減。
3、GD的發(fā)病機制
TSHR主要在甲狀腺細胞中表達，天然配體是TSH。生理狀態(tài)下，TSHR胞外結(jié)構(gòu)域抑制跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域的活性，當(dāng)胞外結(jié)構(gòu)域被TSH特異性結(jié)合，其構(gòu)象改變轉(zhuǎn)化為跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域的激動劑，從而導(dǎo)致TSHR激活，并引起下游細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，以控制甲狀腺生長以及甲狀腺激素的合成與分泌。病理條件下，TSHR結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，在酶解作用下連接A、B兩個亞基的二硫鍵發(fā)生溶解斷裂，TSHR-A亞基脫落表達于細胞表面，誘發(fā)并增強自身免疫反應(yīng)，使TSHR作為自身抗原激發(fā)機體產(chǎn)生抗體TSAb從而導(dǎo)致甲亢的發(fā)生。因此，具有免疫原性的TSHＲ-A亞基是誘發(fā)自身免疫反應(yīng)的關(guān)鍵，針對TSHR-A亞基的研究成為GD模型研究的熱點。
4、GD動物造模方法
目前GD發(fā)病機制尚不明確，建立符合GD發(fā)病特點的動物模型，對疾病的診斷及治療研究都具有重要意義。外源性甲狀腺素補充法和免疫誘導(dǎo)甲狀腺腫是建立誘發(fā)性甲亢動物模型的主要方法，其中以表達人TSHR-A亞基的重組腺病毒( Ad-TSHR-289) 免疫誘導(dǎo)的甲亢模型是較為理想且使用廣泛的GD動物模型。
參考案例
The thyrotropin receptor autoantigen in Graves disease is the culprit as well as the victim（The Journal of Clinical Investigation，IF 15.9）
實驗方法
① 腺病毒表達載體的構(gòu)建及體內(nèi)注射
研究者分別構(gòu)建了編碼TSHR游離A亞基（TSHR-289）和TSHR全長（TSHR-D1NET，經(jīng)歷最小程度的亞基切割）的腺病毒，并以Ad-β-gal及Ad-TSHR-WT作為對照。將上述腺病毒肌肉注射至6-7周齡雌性BALB/c小鼠，病毒用量為1011 particles，注射體積為50μL PBS混懸液。
腺病毒裝載的三種不同結(jié)構(gòu)形式的TSHR
② 腺病毒免疫方法
腺病毒注射小鼠三次，且每次間隔三周，并在第二次注射后1周抽血，在第三次注射后8周（第一次實驗）或4周（第二次實驗）對動物實施安樂死，以獲得血液和甲狀腺。
實驗結(jié)果
二次免疫后血清甲狀腺素水平檢測顯示Ad-TSHR-289組有80%的小鼠T4水平增高，而Ad-TSHR-D1NET組僅為10% ; 三次免疫后的檢測得到了類似的結(jié)果。組織學(xué)檢查顯示90%的Ad-TSHR-289免疫小鼠表現(xiàn)出明顯的甲狀腺腫，而Ad-TSHR-D1NET免疫小鼠僅有20%出現(xiàn)甲狀腺腫。Ad-TSHR-WT免疫的小鼠表現(xiàn)了介于兩者之間的反應(yīng)。
TSHR腺病毒注射小鼠的甲狀腺腫和組織學(xué)比較
cAMP反應(yīng)測定數(shù)據(jù)顯示二次免疫后Ad-TSHR-289組小鼠血清中的TSAb活性明顯高于Ad-TSHR-D1NET組，而TBAb活性則顯著低于Ad-TSHR-D1NET組，Ad-TSHR-WT組TSAb和TBAb水平介于二者之間。
表達不同結(jié)構(gòu)形式TSHR的腺病毒免疫的小鼠中的TSAb和TBAb
以上數(shù)據(jù)說明游離的TSHR-A亞基具有更強的免疫原性，相比TSHR全長能更有效的誘導(dǎo)小鼠GD的發(fā)病，具有更高的造模成模率。
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參考文獻：
1. Chu YD, Yeh CT. The Molecular Function and Clinical Role of Thyroid Stimulating Hormone Receptor in Cancer Cells. Cells. 2020 Jul 20;9(7):1730.
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4. 覃海知，黃一薇，劉強，李承鉉，李海洋，謝春光. 以 Ad-TSHＲ-289 構(gòu)建 Graves 病動物模型的研究進展. 遼寧中醫(yī)雜志2017年第44卷第7期 .
