【客戶文章】中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所李家立團(tuán)隊(duì)揭示CircRNA在腦衰老中的生物學(xué)作用
中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所李家立團(tuán)隊(duì)揭示CircRNA在腦衰老中的生物學(xué)作用
人體器官的功能會(huì)隨著年齡的增長而逐漸衰退，腦也不例外。腦衰老會(huì)產(chǎn)生涉及分子、細(xì)胞和功能水平的特征性神經(jīng)生理變化，了解這些變化及其分子機(jī)制對(duì)于研究腦衰老及其相關(guān)性疾病具有重要的意義。腦衰老的生物學(xué)機(jī)理十分復(fù)雜，與遺傳、年齡和環(huán)境等多個(gè)因素有關(guān)，其中隨年齡和環(huán)境等因素而變化的表觀遺傳調(diào)控被認(rèn)為是重要的調(diào)節(jié)因素之一。
已有研究報(bào)道哺乳動(dòng)物腦中存在大量的環(huán)狀RNA（CircRNA）。同時(shí)，最近的研究也表明，circRNAs可能作為一種新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與大腦的發(fā)育、成熟和衰老。但是，大腦中大多數(shù)circRNAs的表達(dá)模式和功能尚不清楚，尤其是靈長類動(dòng)物腦中。非人靈長類動(dòng)物由于其在遺傳和生理特征上與人類具有相似性，因此，已成為人類疾病建模和治療策略研究的最有價(jià)值的模型之一。
2018年，為了研究circRNA在哺乳動(dòng)物，尤其是靈長類動(dòng)物大腦中的表達(dá)特點(diǎn)和調(diào)控作用，中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所李家立團(tuán)隊(duì) 以獼猴的腦組織為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行了系統(tǒng)的circRNA表達(dá)特點(diǎn)及功能的研究，相關(guān)研究成果發(fā)表在《Cell Discovery》，題為“Annotation and functional clustering of circRNA expression in rhesus macaque brain during aging ”，文章揭示了circRNA的表達(dá)在獼猴大腦中呈現(xiàn)組織特異性、性別特異性和年齡特異性，并且circRNA與其宿主mRNA之間存在正相關(guān)或負(fù)相關(guān)調(diào)控關(guān)系。
2020年7月，中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所李家立團(tuán)隊(duì) 又在《Nature Communications》（IF=12.121）上發(fā)表了題為“CircGRIA1 shows an age-related increase in male macaque brain and regulates synaptic plasticity and synaptogenesis ”的研究論文，文章在上述研究工作基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)CircGRIA1的表達(dá)在獼猴前額葉皮層和海馬區(qū)具有年齡特異性和雄性特異性 ，并且順式作用于Gria1基因啟動(dòng)子進(jìn)而調(diào)控Gria1基因的表達(dá)；體內(nèi)外操縱circGRIA1表達(dá)能夠負(fù)調(diào)節(jié)Gria1基因的表達(dá)，敲低circGRIA1可顯著改善老年雄性獼猴海馬神經(jīng)元的突觸可塑性及突觸再生 。該論文強(qiáng)調(diào)了CircRNA調(diào)控的重要性，加深了人類對(duì)腦衰老生物學(xué)的了解。
01 CircGRIA1的表達(dá)在獼猴大腦中具有年齡差異性和性別差異性
CircGRIA1是由谷氨酸受體AMPA亞基Gria1基因外顯子4，5，6形成的進(jìn)化保守性circRNA。作者通過qPCR及Northern blot發(fā)現(xiàn)CircGRIA1在雄性獼猴腦中呈現(xiàn)增齡性表達(dá)升高，且與宿主（Gria1）mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。（圖1）
圖1. CircGRIA1和Gria1 mRNA表達(dá)的特征
02 CircGRIA1與Gria1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)
為了進(jìn)一步驗(yàn)證CircGRIA1與其宿主(Gria1)mRNA之間的負(fù)調(diào)控關(guān)系，作者又用BASEscope ISH和RNAscope ISH技術(shù)進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)雄性獼猴CircGRIA1的表達(dá)在前額葉皮層（PFC）和海馬的CA1& DG區(qū)呈現(xiàn)隨年齡增長而上升的趨勢(shì)；而其宿主(Gria1)mRNA的表達(dá)水平則相反。（圖2）
圖2. CircGRIA1與Gria1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)
03 CircGRIA1與其親本基因Gria1啟動(dòng)子區(qū)的關(guān)聯(lián)
為了探討CircGRIA1與其宿主(Gria1)mRNA表達(dá)負(fù)相關(guān)的分子機(jī)制，作者從體內(nèi)外用ChIRP技術(shù)研究了與CircGRIA1反向剪接點(diǎn)共沉淀的片段，發(fā)現(xiàn)CircGRIA1結(jié)合其宿主(Gria1)mRNA的5’UTR，進(jìn)而發(fā)揮負(fù)調(diào)控功能。（圖3）
圖3. CircGRIA1對(duì)親本基因組位點(diǎn)的調(diào)控作用
04 CircGRIA1負(fù)向調(diào)控Gria1 mRNA表達(dá)
作者使用慢病毒載體(MOI=5-10)感染DIV5的胎猴海馬神經(jīng)元，體外操縱CircGRIA1，通過BASEscope ISH和RNAscope ISH技術(shù)檢測(cè)CircGRIA1和其宿主(Gria1)mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DIV28，siRNA感染組的CircGRIA1表達(dá)顯著降低；而其宿主(Gria1)mRNA的表達(dá)水平則升高。（圖4）
圖4. CircGRIA1負(fù)向調(diào)控Gria1 mRNA表達(dá)
05 CircGRIA1參與突觸形成
接下來，作者探討了CircGRIA1和Gria1表達(dá)負(fù)相關(guān)的生理功能，如是否參與了老化過程中突觸形成前后的調(diào)控。首先，作者將AAV9-siRNAs(CircGRIA1)&AAV9-siRNAs(control) 病毒顆粒微注射至10年齡和20年齡雄性和雌性獼猴的海馬區(qū)，6周后，采用BASEscope ISH、RNAscope ISH和RT-qPCR檢測(cè)CircGRIA1和Gria1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)20年齡雄性獼猴海馬中CircGRIA1表達(dá)顯著降低，而Gria1 mRNA表達(dá)升高。（圖5）
圖5. 敲低CircGRIA1會(huì)增加Gria1的表達(dá)
接著，作者從體內(nèi)外檢測(cè)了獼猴腦中幾個(gè)突觸組分表達(dá)的年齡相關(guān)性變化。免疫組織化學(xué)結(jié)果(見圖6)顯示，與10年齡雄性和雌性獼猴相比，20年齡雄性和雌性獼猴PFC和海馬CA1 & DG區(qū)的synapsin-I(突觸前囊泡蛋白)和PSD95（突觸后膜骨架蛋白）表達(dá)水平均顯著降低；敲低CircGRIA1顯著增加了20年齡雄性獼猴海馬中synapsin-I的表達(dá)水平，而PSD95表達(dá)水平幾乎沒有變化。CircGRIA1敲低組的體外結(jié)果跟體內(nèi)結(jié)果一致。
圖6. 敲低CircGRIA1可增加突觸發(fā)生
06 CircGRIA1調(diào)控突觸可塑性
突觸可塑性與谷氨酸受體AMPA和NMDA 介導(dǎo)的神經(jīng)活動(dòng)相關(guān)。微型自發(fā)的興奮性突觸后電流(mEPSCs)用于模擬該神經(jīng)活動(dòng)。作者探究了CircGRIA1是否參與突觸可塑性。作者使用慢病毒載體(MOI=5-10)感染DIV5的胎猴海馬神經(jīng)元，體外操縱CircGRIA1，跟蹤記錄不同時(shí)間點(diǎn)的mEPSCs。結(jié)果顯示DIV28，control組mEPSCs的振幅和頻率均下降，siRNA感染組則緩解了這種下降。
圖7. CircGRIA1調(diào)控突觸可塑性
小 結(jié)
本研究工作表明CircGRIA1的表達(dá)在老年雄性獼猴腦中表達(dá)升高。它主要定位于細(xì)胞核，其與Gria1基因啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合，以順式作用方式負(fù)調(diào)控Gria1的mRNA和蛋白水平。體內(nèi)外敲減CircGRIA1可顯著改善老年雄性獼猴海馬神經(jīng)元的突觸可塑性及突觸再生。這些研究為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和理解靈長類動(dòng)物復(fù)雜的大腦結(jié)構(gòu)和功能，尋找參與腦衰老進(jìn)程的調(diào)控因子提供了新證據(jù)，為探索衰老相關(guān)神經(jīng)疾病的機(jī)理和干預(yù)措施提供了參考。
原文鏈接： https://www.nature.com/articles/s41467-020-17435-7 .
維真生物助力產(chǎn)品及病毒用法
本研究工作表明CircGRIA1的表達(dá)在老年雄性獼猴腦中表達(dá)升高。它主要定位于細(xì)胞核，其與Gria1基因啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合，以順式作用方式負(fù)調(diào)控Gria1的mRNA和蛋白水平。體內(nèi)外敲減CircGRIA1可顯著改善老年雄性獼猴海馬神經(jīng)元的突觸可塑性及突觸再生。這些研究為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和理解靈長類動(dòng)物復(fù)雜的大腦結(jié)構(gòu)和功能，尋找參與腦衰老進(jìn)程的調(diào)控因子提供了新證據(jù)，為探索衰老相關(guān)神經(jīng)疾病的機(jī)理和干預(yù)措施提供了參考。
AAV病毒
AAV9-shRNA(circGRIA1) & AAV9- shRNA(control)
注射動(dòng)物
Three-paired 10- and 20-year-old male and female rhesus macaques weighing 6–10 kg
病毒用量
單側(cè)海馬5次, 20μL/次 (total 100 μL) , titer ~3 × 1014 v.g./mL；對(duì)側(cè)海馬注射等量對(duì)照病毒
注射方式
腦立體定位注射，31-gauge漢密爾頓注射器， rate of 500 nL/min
注射位置
海馬，見圖8
檢測(cè)時(shí)間
6周后
圖8. 病毒注射部位示意圖
維真生物circRNA相關(guān)載體
維真生物科研團(tuán)隊(duì)已成功構(gòu)建了大量circRNA表達(dá)載體，并建立了腺病毒、慢病毒和AAV全套circRNA過表達(dá)和干擾載體系統(tǒng)。
維真生物circRNA過表達(dá)及干擾載體
腺病毒載體
OE（過表達(dá)）
KD（敲低）
慢病毒載體
OE（過表達(dá)）
KD（敲低）
腺相關(guān)病毒載體
OE（過表達(dá)）
KD（敲低）
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