鈣成像技術(shù)

神經(jīng)元的活動(dòng)是大腦復(fù)雜行為表現(xiàn)的基礎(chǔ)。而神經(jīng)元的活動(dòng)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的快速變化。鈣離子作為一類重要的胞內(nèi)信號分子，在神經(jīng)元功能中起著重要的作用，如突觸囊泡中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等。鈣成像技術(shù)可以直接測量神經(jīng)元和神經(jīng)元組織中動(dòng)態(tài)的鈣流動(dòng)，從而達(dá)到檢測神經(jīng)元活動(dòng)的目的。

1、鈣成像原理：利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑，將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來，通過對鈣離子變化的快速成像，反映神經(jīng)元的活性變化。

2、鈣離子指示劑（Calcium Indicators）

對鈣離子的功能研究，鈣指示劑是必不可少的工具。根據(jù)熒光光譜、鈣離子親和力及其化學(xué)特性的不同大致可分為化學(xué)指示劑和遺傳編碼指示劑兩大類。

化學(xué)指示劑是檢測細(xì)胞質(zhì)中鈣離子濃度的傳統(tǒng)工具，主要是一些能特異性與鈣離子結(jié)合的小分子，包括Fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4、Calcium Green-1等，這些小分子都是被稱作BAPTA的鈣離子螯合劑，是乙二醇雙四乙酸（EGTA）的一種同系物，對Ca2+具有較高的選擇性。化學(xué)熒光指示劑通常采用電極刺穿或借助乙酰氧基甲酯和右旋葡萄糖的方式進(jìn)入到目標(biāo)部位。

遺傳編碼鈣離子指示劑（genetically encoded calcium indicators，GECIs），是隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)的一種新型的鈣離子指示劑，它可以實(shí)現(xiàn)在體實(shí)驗(yàn)中對鈣離子的長時(shí)程檢測和實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測，并且還可以借助細(xì)胞器的特異性定位信號表征某些特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的鈣離子變化情況。

根據(jù)發(fā)光原理可將GECIs分為兩大類，以單個(gè)熒光蛋白為基礎(chǔ)的GECIs和由熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的熒光蛋白對構(gòu)成的GECIs。前者主要包括Pericams、GCaMP和Camgaroos，后者主要包括TN-XXL、Cameleons、D3cpV等。GECIs類鈣指示劑則主要借助于病毒感染的方式導(dǎo)入至目標(biāo)部位。

遺傳編碼鈣離子指示劑
（Jihae Oh et al. Korean J Physiol Pharmacol. 2019）

3、GCaMPs鈣指示劑

在GECIs中，以結(jié)構(gòu)導(dǎo)向設(shè)計(jì)的GCaMP應(yīng)用最為廣泛。GCaMPs是單個(gè)綠色熒光蛋白GFP、鈣調(diào)蛋白CaM和平滑肌細(xì)胞肌球蛋白輕鏈激酶片段M13融合的產(chǎn)物。在Ca2+存在的情況下，CaM會(huì)和M13結(jié)合，大大增加熒光的強(qiáng)度。其結(jié)構(gòu)示意圖和成像原理如下圖所示。

4、鈣成像研究步驟

下面以遺傳編碼類鈣離子指示劑為例，簡述研究步驟：
第一步：選取合適的GECIs類鈣離子指示劑；
第二步：通過病毒感染的方式將鈣離子指示劑導(dǎo)入目標(biāo)位置；
第三步：記錄鈣離子的動(dòng)態(tài)變化，分析神經(jīng)元活動(dòng)。

5、如何選擇合適的鈣指示劑(以GCaMPs為例)

自2001年GCaMP1問世以來，科學(xué)家們通過基于結(jié)構(gòu)的突變和基于神經(jīng)元的篩選方法不斷優(yōu)化GCaMP的親和性、信噪比、動(dòng)力學(xué)和動(dòng)態(tài)范圍等，先后成功開發(fā)過GCaMP2,GCaMP3,GCaMP5、GCaMP6和jGCaMP7，以滿足研究者不同的成像實(shí)驗(yàn)。那么，面對眾多的GCaMPs鈣指示劑，我們該如何選擇呢？眾所周知，不同的成像實(shí)驗(yàn)需要使用不同性質(zhì)的GCaMP，如本底熒光低的GCaMP適用于寬視場成像技術(shù)，可以同時(shí)檢測大量神經(jīng)元的活動(dòng)，這主要是由于大量神經(jīng)元被GCaMP標(biāo)記，光子數(shù)多，容易形成比較強(qiáng)的背景熒光；本底熒光高的適用于檢測神經(jīng)亞細(xì)胞的信號，如樹突棘和軸突，這主要是由于這些神經(jīng)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)體積小，GCaMP表達(dá)少，光子數(shù)少，背景熒光低甚至可以被忽略；快動(dòng)力學(xué)的GCaMP適合檢測神經(jīng)元放電模式的動(dòng)態(tài)變化；慢動(dòng)力學(xué)的GCaMP則適合檢測所有活動(dòng)的神經(jīng)元。下表是GCaMP6和jGCaMP7系列探針的特點(diǎn)：

6、維真鈣指示劑產(chǎn)品列表

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8、參考文獻(xiàn)：

1. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors；
2. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity；
3. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.