Brainbow為何如此絢爛多彩？探究成像背后熒光蛋白的奧秘
圖片來(lái)源于：Hippocampus, By Tamily Weissman, Harvard University
上述如此絢麗多彩的圖片是科學(xué)家采用2007年哈佛大學(xué)腦科學(xué)中心開(kāi)發(fā)的Brainbow（彩虹腦）技術(shù)對(duì)小鼠海馬齒狀回DG進(jìn)行多色標(biāo)記的結(jié)果。
Brainbow是一項(xiàng)采用含多色熒光蛋白XFP的重組載體標(biāo)記大腦的成像技術(shù)，其技術(shù)精髓就是XFP，技術(shù)核心是Cre/Loxp系統(tǒng)。具體來(lái)說(shuō)，在Cre/Loxp系統(tǒng)的刪除或(和)顛倒作用下， 由單個(gè)啟動(dòng)子在一種細(xì)胞群中驅(qū)動(dòng)兩到四個(gè)XFP隨機(jī)表達(dá)；多個(gè)Brainbow轉(zhuǎn)基因拷貝的整合誘發(fā)這些XFP的組合表達(dá)，從而創(chuàng)造出更多的色彩。在神經(jīng)系統(tǒng)中，由此產(chǎn)生的多色標(biāo)記可以用來(lái)區(qū)分相鄰的神經(jīng)元細(xì)胞或膠質(zhì)細(xì)胞，并在追蹤神經(jīng)環(huán)路的同時(shí)確定神經(jīng)元突起的身份，從而幫助科學(xué)家解析大腦。
那么，作為Brainbow技術(shù)精髓的XFP，我們又了解多少呢？本期我們將帶領(lǐng)大家深入、全面地了解熒光蛋白。
在正式介紹熒光蛋白之前，我們先來(lái)了解幾個(gè)光學(xué)基本概念：
熒光物質(zhì)、激發(fā)光和熒光
我們?cè)趯?duì)樣品進(jìn)行熒光成像時(shí)，首先樣品需要進(jìn)行熒光標(biāo)記，其次用某種波長(zhǎng)的入射光進(jìn)行照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的發(fā)射光。在這過(guò)程中，用來(lái)標(biāo)記樣品并使其具有發(fā)光性質(zhì)的物質(zhì)叫熒光物質(zhì)，而照射樣品的入射光叫激發(fā)光，發(fā)出來(lái)的發(fā)射光就叫熒光。
發(fā)光原理
當(dāng)熒光物質(zhì)被激發(fā)光照射后，激發(fā)光的能量就會(huì)供給熒光物質(zhì)，熒光物質(zhì)吸收能量后發(fā)生能級(jí)躍遷，即由低能級(jí)的基態(tài)躍遷至高能級(jí)的激發(fā)態(tài)。而高能級(jí)的激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，所以會(huì)恢復(fù)至低能級(jí)的基態(tài)。在這過(guò)程中，熒光物質(zhì)吸收的能量就會(huì)以光的形式進(jìn)行釋放，從而產(chǎn)生熒光。而事實(shí)上，在能量釋放過(guò)程中還有一部分是被喪失掉的，因此發(fā)射光的能量低于激發(fā)光的能量，相對(duì)應(yīng)地，發(fā)射光的波長(zhǎng)要比激發(fā)光的波長(zhǎng)長(zhǎng)。熒光物質(zhì)發(fā)光的整個(gè)過(guò)程可用Jablonski能量圖來(lái)表示（圖1）。
圖1：雅布倫斯基(Jablonski)能量示意圖
（https://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/jablonski/jabintro/）
熒光光譜
熒光光譜分為激發(fā)光譜和發(fā)射光譜兩種：激發(fā)光譜是熒光物質(zhì)在不同波長(zhǎng)的激發(fā)光作用下記錄的熒光強(qiáng)度隨激發(fā)光波長(zhǎng)的變化情況；而發(fā)射光譜則是在固定波長(zhǎng)的激發(fā)光作用下記錄的熒光強(qiáng)度隨發(fā)射光波長(zhǎng)的變化情況。
無(wú)論是激發(fā)光譜還是發(fā)射光譜，記錄的均是熒光強(qiáng)調(diào)隨波長(zhǎng)的變化情況，不同的是隨誰(shuí)的波長(zhǎng)而變化。電磁波波普將有助于我們了解各波普的波長(zhǎng)，從而為我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)（圖2）。
圖2：電磁波的波普
（Cahyadi, W.A.; Chung, Y.H.; Ghassemlooy, Z.; Hassan, N.B. Electronics 2020, 9, 1339.）
接下來(lái)我們就正式介紹熒光蛋白：
自1994年GFP首次被用于標(biāo)記基因后，熒光蛋白（Fluorescent proteins，F(xiàn)Ps）就成了生命科學(xué)領(lǐng)域中非常重要的細(xì)胞成像工具之一。這些FPs借助高分辯率顯微技術(shù)能夠幫助我們觀察先前無(wú)法看到的生物過(guò)程，如活細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程、信號(hào)通路，大腦中的突觸鏈接，癌細(xì)胞的擴(kuò)散等。
熒光蛋白的結(jié)構(gòu)
在1996年，GFP的晶體結(jié)構(gòu)被科學(xué)家成功解析：GFP是典型的β桶形結(jié)構(gòu)，包括11條β折疊和α螺旋：11條β折疊緊密交織在一起形成圓柱狀的“柵欄”，α螺旋上的第65、66、67位氨基酸（絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸）位于其正中位置，在分子氧的作用下，經(jīng)過(guò)環(huán)化、脫氫等作用最終形成成熟的熒光基團(tuán)，嚴(yán)密的桶形結(jié)構(gòu)保護(hù)著熒光基團(tuán)，防止它被周圍環(huán)境淬滅（圖3a和3b）；N端和C端均暴露在外面。
圖3a：GFP的結(jié)構(gòu)；
圖3b：GFP發(fā)色團(tuán)形成的步驟
（Day, R. N. and M. W. Davidson (2009). Chem Soc Rev 38(10): 2887-2921.）
FPs的種類五花八門，就FPbase中收錄的就831種，幾乎覆蓋了從紫外光到遠(yuǎn)紅外光的所有光譜波段。盡管這些FPs的光學(xué)特性大相徑庭，但是它們的結(jié)構(gòu)卻極其相似。結(jié)構(gòu)決定功能，人們對(duì)FPs結(jié)構(gòu)的深刻認(rèn)識(shí)對(duì)于理解其功能及拓展其范圍具有非常重要的理論意義。
合適熒光蛋白的選擇指南
面對(duì)琳瑯滿目的FPs，研究人員在具體科學(xué)研究中往往受到一系列問(wèn)題的困擾，如哪些FPs好用？哪些FPs亮度高？哪些因素影響理想FPs的選擇？下面我們就從如下幾方面一一展開(kāi)討論，旨在為大家縮小選擇范圍提供參考。
①亮度/Brightness
FP的亮度由多種因素決定，包括FP固有的亮度（通常由其成熟速度和效率、消光系數(shù)、量子產(chǎn)量和光穩(wěn)定性[長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)中]決定）、成像設(shè)備的光學(xué)特性（照射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度，濾光片的光譜和二色鏡）和照相機(jī)或人眼對(duì)發(fā)射光譜的敏感性。雖然這些因素?zé)o法從整體上鑒定更亮的FP，但是在各個(gè)光譜波段內(nèi)還是有可能鑒定較亮的FP，因?yàn)檫@主要取決于其固有的光學(xué)特性。更亮的FP意味著可以用更低的激發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行成像，從而更好地保護(hù)樣品免受光損傷。而且，更亮的FP可以提供檢測(cè)和成像所需的足夠信號(hào)。下表是各光譜波段推薦的FPs（表1）。
表1：推薦的熒光蛋白的特征
（Shaner, N. C., et al. (2005). Nat Methods 2(12): 905-909.）
②表達(dá)/Expression
大多數(shù)FPs來(lái)源于海洋生物，而我們研究的基因大多數(shù)來(lái)自于哺乳動(dòng)物。這兩種物種的密碼子偏好性存在較大差異，這種差異很可能會(huì)造成FP在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中低表達(dá)甚至不表達(dá)，進(jìn)而觀察不到熒光。因此，用于成像實(shí)驗(yàn)的FPs往往都需要根據(jù)所表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其能夠很好地表達(dá)。慶幸的是，目前我們所使用的FPs已針對(duì)哺乳動(dòng)物的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，而且可以很好地表達(dá)。FPs需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊、熒光基團(tuán)形成等步驟形成成熟蛋白后才能發(fā)光。雖然，大多數(shù)經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的FPs能在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中很好地表達(dá)，但是其折疊效率有快有慢，從而決定了其成熟時(shí)間不同。因此，F(xiàn)Ps的成熟時(shí)間也需考慮在內(nèi)，在進(jìn)行目標(biāo)蛋白亞細(xì)胞定位時(shí)，我們需要根據(jù)其壽命選擇相應(yīng)的FP。
③ 光穩(wěn)定性/Photostability
所有FPs最終都會(huì)在長(zhǎng)時(shí)間的激發(fā)光照射下發(fā)生光漂白，從而逐漸喪失發(fā)光能力，但是其光漂白速率迥異。因此，針對(duì)不同的成像實(shí)驗(yàn)，我們需要選擇不同光穩(wěn)定性的FP：對(duì)于需要不多于10張圖片的短期成像實(shí)驗(yàn)，光穩(wěn)定性通常不是一個(gè)主要考慮因素，但在需要大量圖片的長(zhǎng)期成像實(shí)驗(yàn)中，選擇極具光穩(wěn)定性的FP是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。
④聚合性質(zhì)/Oligomerization
對(duì)于蛋白亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)，我們?cè)跇?gòu)建熒光融合蛋白時(shí)要選擇單體性質(zhì)的FPs，因?yàn)槎嗑垠w的FPs很可能會(huì)能影響目標(biāo)蛋白的功能或定位。
⑤環(huán)境敏感性/Environmental sensitivity
大多數(shù)FPs具有不同程度的酸敏感性，有的適合在酸性環(huán)境下使用，有的適合在堿性環(huán)境下使用，因此，在不同酸堿度溶液成像中，我們選擇FPs時(shí)還需考慮其PK 值（用于指示FPs的pH敏感性，PK 值越小酸性越強(qiáng)）。在特定條件下，那些對(duì)pH敏感的FPs可以指示細(xì)胞內(nèi)酸堿度的變化，例如單標(biāo)（GFP-LC3B）和雙標(biāo)（mCherry-GFP-LC3B）自噬指示系統(tǒng)就是利用了GFP和mCherry不同的酸敏感性來(lái)追蹤自噬流的。
⑥多色標(biāo)記/Multiple labeling
自GFP被首次用于標(biāo)記基因后，水母來(lái)源的GFP不斷被改造，得到了大量藍(lán)色、青色和黃色的衍生物。同時(shí)，來(lái)自其他物種的FPs也被陸續(xù)鑒定，進(jìn)一步將FPs的顏色拓展至橙色、紅色和紅外光譜區(qū)。從FPs被改造的整個(gè)過(guò)程，我們可以看出，F(xiàn)Ps的改造趨向紅移。因?yàn)镕Ps越紅越好，顏色越紅意味著波長(zhǎng)越長(zhǎng)，對(duì)應(yīng)的激發(fā)光波長(zhǎng)也更長(zhǎng)，長(zhǎng)波長(zhǎng)光的激發(fā)對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷小，且背景自發(fā)熒光和動(dòng)物組織的光吸收都非常小，組織穿透力強(qiáng)（圖4）。這些特征使得紅色FPs更適合于體內(nèi)深組織成像。
圖4：光的吸收和穿透范圍
（Keereweer, S., et al. (2013). Clin Cancer Res 19(14): 3745-3754.）
這些五顏六色的FPs為我們選擇FPs進(jìn)行多色標(biāo)記實(shí)驗(yàn)提供了豐富的資源。值得注意的是，在選擇FPs顏色的同時(shí)還要兼顧它們的兼容性：一個(gè)好的經(jīng)驗(yàn)法則是，兩種FPs的峰激發(fā)波長(zhǎng)和峰值發(fā)射波長(zhǎng)均應(yīng)相隔50-60nm。
⑦設(shè)備兼容性/Opitical setup
選擇FPs進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)時(shí)，所選FPs的光譜范圍需滿足實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有成像設(shè)備的需求，畢竟重新購(gòu)買成像設(shè)備成本還是比較高的。推薦使用的成像設(shè)備濾光片組合見(jiàn)表2。
表2：推薦的成像設(shè)備濾光片組合
（Shaner, N. C., et al. (2005). Nat Methods 2(12): 905-909.）
熒光蛋白的應(yīng)用
如今，F(xiàn)Ps作為標(biāo)記蛋白和報(bào)告蛋白被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的諸多領(lǐng)域，以研究生命系統(tǒng)的組織和功能（圖5）。
圖5：FPs的主要應(yīng)用領(lǐng)域
（Chudakov, D. M., et al. (2010). Physiol Rev 90(3): 1103-1163.）
①標(biāo)記蛋白
作為標(biāo)記蛋白，構(gòu)建熒光融合蛋白(Fluorescent Fusion Protein, FFP)可以用于研究蛋白定位，追蹤其動(dòng)態(tài)變化，追溯其歷史和研究蛋白之間的相互作用。那么，如何構(gòu)建FFP呢？在設(shè)計(jì)FFP時(shí)，我們需要考慮多方面的因素，如FFP的預(yù)期用途，選擇哪種FP，插入位置等等。隨著FPs的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展，很多熒光蛋白載體可通過(guò)商業(yè)化公司獲得?？v觀這些載體，F(xiàn)P通常位于多克隆位點(diǎn)附近（即目標(biāo)蛋白的N端或C端，圖6）。在根據(jù)上述FP選擇指南選定載體后，我們僅需通過(guò)簡(jiǎn)單的亞克隆技術(shù)將目標(biāo)蛋白克隆至多克隆位點(diǎn)區(qū)即可。當(dāng)FP位于目標(biāo)蛋白C端時(shí)，為了確保兩者的正確折疊和功能，一段由2-10個(gè)氨基酸組成的鏈接序列（GS間隔，linker）往往是有用的。
圖6a：Clontech pEGFP-C1載體信息 圖6b：Clontech pEGFP-N1載體信息
但是，在許多情況下，我們需要根據(jù)目標(biāo)蛋白的實(shí)際情況修飾FFP，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白和膜蛋白：一個(gè)典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白通常含有兩段關(guān)鍵序列（信號(hào)序列，SS；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列，KDEL），若其功能域靠近C端，F(xiàn)P應(yīng)置于SS下游2-10個(gè)氨基酸處，這樣可以提高SS的切割效率，并有利于FFP的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位；若其功能域靠近N端，F(xiàn)P應(yīng)插入KDEL之前；對(duì)于單次跨膜蛋白，F(xiàn)P不能置于跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)內(nèi)/附近，因?yàn)檫@將破壞結(jié)構(gòu)域并導(dǎo)致膜整合的問(wèn)題；對(duì)于多次跨膜蛋白，除了單次跨膜蛋白的不適位置外，F(xiàn)P也不可置于TMDs之間的環(huán)內(nèi)，因?yàn)門MDs之間的精確間距對(duì)于其正確折疊非常重要，且這些環(huán)通常包含功能域（圖7）。另外，還有些目標(biāo)蛋白在成熟過(guò)程中會(huì)切掉一段，如自噬標(biāo)志物L(fēng)C3。
圖7：FFP中FP的理想插入位置
（Chudakov, D. M., et al. (2010). Physiol Rev 90(3): 1103-1163.）
總之，不管如何構(gòu)建FFP，我們均需要確保FFP的序列正確，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其是否發(fā)光，其定位模式是否與目標(biāo)蛋白的類似，是否保留有目標(biāo)蛋白的功能等等。
②報(bào)告蛋白
作為報(bào)告蛋白，F(xiàn)Ps借助極具市場(chǎng)前景的AAV病毒載體被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究的各個(gè)階段，包括神經(jīng)標(biāo)記，基因操作，生理操縱和生理觀察。下面我們僅列舉幾個(gè)例子說(shuō)明：
案例1：FPs用于標(biāo)記全腦和局部腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞（圖8）
圖8a：較AAV9，1×10 11vg AAV-PHP.eB-tdTomato高效標(biāo)記C57BL/6J小鼠的全腦神經(jīng)細(xì)胞，而不標(biāo)記B6C3小鼠的
（Mathiesen, S. N., et al. (2020). Mol Ther Methods Clin Dev 19: 447-458.）
圖8b：1.5-2ul AAV5-hSyn-EGFP標(biāo)記海馬腹側(cè)下托神經(jīng)元
圖8c：2ul AAV5-hSyn-mCherry標(biāo)記孤束核神經(jīng)元
（圖片來(lái)源于客戶）
案例2：添加靶序列和滯留序列的FPs用于標(biāo)記亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和追蹤其動(dòng)態(tài)變化（圖9）
圖9：Ach3.0質(zhì)粒和帶亞細(xì)胞標(biāo)記物的mScarlet共轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞的熒光圖片
注：Ach3.0：第二代綠色乙酰膽堿熒光探針；CAAX：細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)記物；SYP（ synaptophysin）：突觸前標(biāo)記物
（Jing, M., et al. (2020). Nat Methods 17(11): 1139-1146.）
結(jié) 語(yǔ)
隨著技術(shù)的進(jìn)步，越來(lái)越多的FPs被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用。因此，科研人對(duì)于FPs可以說(shuō)是眾所周知。盡管目前已有的FPs為科研人的各種成像實(shí)驗(yàn)帶來(lái)了眾多選擇。但是，隨著研究的深入，科研人對(duì)于成像實(shí)驗(yàn)提出了更高的需求，尤其在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)縱橫交錯(cuò)的神經(jīng)系統(tǒng)中體現(xiàn)地淋漓盡致。未來(lái)，亮度高、穩(wěn)定性高的單體FPs將可以進(jìn)行更密集的成像實(shí)驗(yàn)；高效折疊的單體光轉(zhuǎn)換FPs將提高我們光標(biāo)記融合蛋白的能力，F(xiàn)Ps光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端將繼續(xù)拓寬，使科研人能夠在深組織和整個(gè)動(dòng)物中進(jìn)行更靈敏、更高效的成像實(shí)驗(yàn)。
參考文獻(xiàn)：
1、Day, R. N. and M. W. Davidson (2009). "The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging." Chem Soc Rev 38(10): 2887-2921.
2、2、Shaner, N. C., et al. (2005). "A guide to choosing fluorescent proteins." Nat Methods 2(12): 905-909.
3、Keereweer, S., et al. (2013). "Optical image-guided cancer surgery: challenges and limitations." Clin Cancer Res 19(14): 3745-3754.
4、Chudakov, D. M., et al. (2010). "Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues." Physiol Rev 90(3): 1103-1163.
5、Mathiesen, S. N., et al. (2020). "CNS Transduction Benefits of AAV-PHP.eB over AAV9 Are Dependent on Administration Route and Mouse Strain." Mol Ther Methods Clin Dev 19: 447-458.
6、Jing, M., et al. (2020). "An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity." Nat Methods 17(11): 1139-1146.
