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重組腺病毒的制備和使用

1. 重組腺病毒的制備

1.1 細胞轉(zhuǎn)染（以轉(zhuǎn)染 6孔板為例）

① 250μl DMEM和9μl PEI配成Mix1，靜置5min以上。

② 250μl DMEM和1μg穿梭質(zhì)粒、2μg包裝質(zhì)粒（即腺病毒骨架質(zhì)粒），配成Mix2。

③ 將Mix1和Mix2混合，渦旋振蕩混勻，瞬離后，靜置30min以上，以便有充足的時間形成DNA-PEI復(fù)合物。

④ 靜置期間鋪6孔板HEK293細胞，細胞數(shù)約0.3-0.5×10⁶個/孔（也可提前鋪板）。

⑤ 將靜置后的混合液逐滴加入至6孔板細胞中。十字混勻后置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 擴增、收毒步驟

① 轉(zhuǎn)染后約14天，將六孔板中有CPE的細胞連同培養(yǎng)基吹下加入至10cm dish，混勻后置于 CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

② 收集有CPE的10cm dish細胞，用電動移液器轉(zhuǎn)移至 15mL離心管中，并做好相應(yīng)的標(biāo)記；

③ 3500rpm,離心7min；離心完成后，取出離心管，保留細胞沉淀，并將上清保存至其他離心管中備用。

④ 在細胞沉淀中加入腺病毒凍存液，用移液槍不斷地吹打沉淀，保證完全回溶，吸到1.5mL EP管中。

⑤ -80℃及 37℃反復(fù)凍融四次。

⑥ 凍融完成后，12000g離心2min。

⑦ 將上清用1mL槍移到二維碼管中，存放于-80℃的冰箱中。

1.3 大量擴增及收毒步驟

① 將收集起來的病毒上清平均滴加到10個10cm dish中，混勻后置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天后收毒；

② 收集有CPE的10個10cm dish細胞，用電動移液器轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，并做好相應(yīng)的標(biāo)記；

③ 3500rpm,離心7min，分別收集上清和細胞沉淀；

④ 病毒上清加入PEG8000和NaCl，混勻后4℃直立放置過夜；細胞沉淀置于-80℃保存?zhèn)溆谩?

1.4 純化前的處理

① 病毒上清處理

a. 第二天將4℃過夜的上清離心，3500g，4℃，離心 30min；

b. 離心后棄掉上清，收集病毒沉淀；

c. 用2mL凍存液將病毒沉淀重懸，收集到15ml管中備用。

② 細胞沉淀處理

a. 細胞沉淀用6mL腺病毒凍存液重懸，混勻，反復(fù)凍融四次；

b. 凍融完畢后，3500g，4℃，離心30min，分別收集上清和沉淀（細胞碎片）；

c.上清與重懸后的病毒沉淀混合；細胞碎片用2mL凍存液進行重懸；

③ 超聲波破碎細胞

a. 重懸后的細胞碎片超聲波破碎3-4次，至液體不粘稠；

b. 超聲完畢后，將液體分裝到2個EP管中，12000g，4℃離心10min；

c. 離心完成后，與病毒上清和細胞沉淀處理后的樣品混合。

1.5 純化與濃縮

① 純化——碘克沙醇密度梯度離心。

a. 配制不同濃度的碘克沙醇；

b. 取一個超離管，用電動移液器逐層、緩慢加入不同濃度的碘克沙醇；

c. 將處理好的病毒液加入到最上層；

d. 超速離心，48000rpm，2h30min。離心前應(yīng)將對應(yīng)的超離管配平，誤差控制在0.1g以內(nèi)。

② 濃縮

a. 離心完畢后，將超離管底用針頭刺破，收集腺病毒所在層至15mL管中；

b. 將收集的病毒液用凍存緩沖液稀釋至體積15mL，然后用0.2μm的濾膜過濾；

c. 將過濾后的液體置于一個15mL的超濾管中，3500g離心50min進行濃縮，一般離心2-3次后達到預(yù)定體積；

d. 將超濾管中剩下的液體反復(fù)吹打后吸至病毒儲存管中，標(biāo)明名稱和日期。

e. 將收集起來的病毒渦旋震蕩混勻后離心，吸10μL病毒液進行滴度檢測。

1.6 病毒滴度檢測

實時定量PCR法是一種簡單的、高通量的測定病毒粗提裂解液和純化病毒樣本中腺病毒顆粒數(shù)量的方法。每個模板的Ct值與該模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析。

① 去除游離DNA分子

先將病毒稀釋10倍，以保證樣品中游離的DNA充分降解：取5μl病毒至45μl PBS緩沖液中，充分混勻。按以下體系配制Mixture：

37℃ 孵育30 min，95℃加熱5min使DNA酶失活。

② 去除病毒蛋白外殼

向上述體系中再加入 1μl蛋白酶K（5μg/μl）。37℃ 孵育30 min；再加30ul超純水稀釋至40ul（至此病毒原液稀釋100倍），95℃加熱5 min使蛋白酶K失活，然后12000rpm，離心2min，取上清進行qPCR檢測。

③ qPCR 將步驟2得到的上清，取5μl進行10倍梯度稀釋，即病毒原液稀釋了1000倍。分別取2μl待測樣品及標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進行qPCR檢測。

qPCR反應(yīng)體系如下：

qPCR反應(yīng)程序：

④ 數(shù)據(jù)分析

病毒顆粒數(shù)的計算：病毒顆粒數(shù)(VP/mL) =與標(biāo)準(zhǔn)品相對值×1000

2. 重組腺病毒的使用

2.1 腺病毒體外感染細胞

① 腺病毒感染目的細胞預(yù)實驗

不同細胞系細胞表面的腺病毒受體數(shù)量不同，這就決定了不同細胞系所使用的MOI會有所不同。通常，易感染細胞系所使用的MOI范圍為10-100。 但是，對于某些難感染的細胞系，MOI可能需要高達1000。對于大多數(shù)細胞系來說，最佳MOI的范圍很窄。我們建議您查閱文獻或者在正式實驗前，在目的細胞中用報告基因的腺病毒進行預(yù)實驗摸最佳MOI。

為了節(jié)省病毒，推薦使用96孔板進行預(yù)實驗。操作步驟如下：

a. 第一天細胞的準(zhǔn)備

將目的細胞接種于96孔板中，細胞融合率為50%較佳。為保證細胞生長良好，請保證細 胞貼壁過夜。

b. 第二天病毒的稀釋

取 10μL腺病毒原液加入90μL培養(yǎng)液中做1:10稀釋（10^-1），以此為起點做梯度稀釋直至稀釋10^-7?？筛鶕?jù)實際情況降低或提高稀釋倍數(shù)。

c. 第二天感染目的細胞

取出提前準(zhǔn)備好的96孔板，用準(zhǔn)備好的病毒稀釋液替代舊培養(yǎng)液，注意保留未加入病毒的 細胞孔作為對照組。

d. 第二至四天觀察熒光或檢測

腺病毒對細胞的感染較快，請在感染細胞后12、24、36、48小時分別觀察細胞中熒光表達 情況（如果您選擇的產(chǎn)品不帶有熒光標(biāo)簽，請在 48、72、96、120小時分別收獲細胞并通 過 Western-Blot或其他檢測手段來檢測基因表達）。

② 腺病毒感染目的細胞實驗

進行腺病毒感染實驗時可使用完全培養(yǎng)液（培養(yǎng)目的細胞用）稀釋。培養(yǎng)液中的血清、雙抗或其他營養(yǎng)因子不會影響腺病毒的感染效率。 以 24孔培養(yǎng)板為例，進行HEK293細胞的感染實驗操作步驟如下：

最適病毒用量的計算公式： 病毒用量pfu=最佳MOI×細胞數(shù)目/病毒滴度

例如,如果您目的細胞的最佳MOI=10，您需要感染10⁶的細胞，那么您共計需要107pfu的病毒.如果病毒滴度為1×10¹⁰ pfu/mL,那么您實驗需要的病毒量就是1ul.

a. 第一天細胞的準(zhǔn)備

在24孔培養(yǎng)板接種若干孔，每個孔內(nèi)接種3-5×10⁴個 HEK 293細胞，鋪板時細胞的融合率為50%左右，每孔培養(yǎng)液體積為300μL(進行病毒感染時細胞的匯合度約為70% )。

b. 第二天病毒的準(zhǔn)備

根據(jù)實驗的實際情況和MOI值，用培養(yǎng)液準(zhǔn)確稀釋腺病毒原液。 注意事項：可使用 PBS緩沖液或無血清培養(yǎng)液稀釋病毒原液。

c. 第二天感染目的細胞

在目的細胞和對照細胞中分別加入計算好的病毒液，混勻后放于CO₂培養(yǎng)箱（37℃、 5% CO₂）孵育過夜。

d. 第三天更換培養(yǎng)液 病毒感染細胞12小時后，更換培養(yǎng)液。

e. 第三天感染效率檢測

感染 24小時后，可利用倒置熒光顯微鏡觀察病毒感染目的細胞的效率。如選擇的腺病毒載 體不帶有熒光標(biāo)記，可以通過Q-PCR(定量PCR)檢測目的基因的表達來評估感染效率。

基因過表達

基因沉默

基因編輯