腺相關(guān)病毒病毒簡介
腺相關(guān)病毒/AAV結(jié)構(gòu)
腺相關(guān)病毒的直徑在20-26nm范圍內(nèi)，其直徑為腺病毒的1/5，慢病毒的1/4，呈現(xiàn)20面體結(jié)構(gòu)，對分裂細胞和非分裂細胞均可感染。
腺相關(guān)病毒/AAV基因組
腺相關(guān)病毒含有約4.7kb的單鏈線性DNA基因組?；蚪M兩端為末端反向重復(fù)序列(ITR)，對于病毒的復(fù)制和包裝具有重要作用；中間基因組編碼兩類蛋白Rep和Cap，Rep蛋白參與病毒的復(fù)制和整合，Cap蛋白為病毒衣殼蛋白。衣殼包含三種類型的亞基VP1、VP2和VP3，比例為1:1:10(VP1:VP2:VP3)?；贏AV的基因組結(jié)構(gòu)，基因工程化的AAV載體刪除了全部AAV蛋白編碼序列，添加了外源基因的表達盒。唯一的病毒來源序列是ITR，它們是在病毒包裝過程中指導(dǎo)AAV復(fù)制和包裝所必需的。病毒編碼序列的完全去除使AAV的包裝能力最大化，并且有助于它們在體內(nèi)遞送時的低免疫原性和細胞毒性。
腺相關(guān)病毒/AAV血清型
現(xiàn)階段研究人員已發(fā)現(xiàn)12種人類AAV 血清型（AAV1至AAV12）和 100多種非人類靈長動物AAV血清型。不同AAV血清型具有不同的衣殼蛋白空間結(jié)構(gòu)、序列和組織特異性，因而其識別與結(jié)合的細胞表面受體也相應(yīng)有很大差別，這也導(dǎo)致不同血清型轉(zhuǎn)染的組織類型、細胞類型和感染效率也各不相同。表一是人類AAV1至AAV9識別的細胞表面受體；表二是AAV1至AAV9的不同組織親噬性。
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Serotype
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Glycan recognitiona
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Coreceptor
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AAV1
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Neu5Aca2-3GalNAcβ1-4GlcNAc
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Unknown
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AAV2
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2-O-and N-sulfated heparin
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Fibroblast / hepatocyte growth factor receptor;
laminin receptor; integrin αVβ5 and α5β1
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AAV3
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2-O-and N-sulfated heparin
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Hepatocyte growth factor receptor; Laminin receptor
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AAV4
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Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc
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Unknown
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AAV5
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Neu5Acα2-3(6S)Galβ1-4GlcNAc
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Platelet-derived growth factor receptor
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AAV6
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Neu5Acα2-3GalNAcβ1-4GlcNAc; N-sulfated heparin
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Epidermal growth factor receptor
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AAV7
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Unknown
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Unknown
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AAV8
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Unknown
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Laminin receptor
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AAV9
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Galactose
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Laminin receptor
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Tissue
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Optimal Serotype
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CNS
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AAV1，AAV2，AAV4，AAV5，AAV8，AAV9
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Heart
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AAV1，AAV8，AAV9
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Kidney
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AAV2
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Liver
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AAV7，AAV8，AAV9
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Lung
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AAV4，AAV5，AAV6，AAV9
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Pancreas
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AAV8
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Photoreceptor Cells
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AAV2，AAV5，AAV8
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RPE(Retinal Pigment Epithelium)
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AAV1，AAV2，AAV4，AAV5，AAV8
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Skeletal Muscle
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AAV1，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9
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腺相關(guān)病毒/AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞過程
AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的過程起始于識別細胞表面糖基化修飾的受體，由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞觸發(fā)AAV內(nèi)化入細胞胞漿，進入內(nèi)體。AAV在細胞骨架蛋白網(wǎng)絡(luò)的幫助下由細胞胞漿向細胞核運輸。在內(nèi)體的酸性環(huán)境下，AAV的衣殼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化。AAV逃離內(nèi)體后或者由蛋白酶體進行蛋白降解，或者入核和脫衣殼，雙鏈轉(zhuǎn)化，進而形成環(huán)形附加體游離于細胞核。下圖是AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的過程。
ssAAV & scAAV
目前，研究人員常用的兩類AAV分別為single-stranded AAV (ssAAV) and self-complementary AAV (scAAV)。scAAV是基于2個基礎(chǔ)被開發(fā)的：一個是理論基礎(chǔ)：無論scAAV還是rAAV，病毒顆粒中均可包裹二倍體，甚至四倍體的AAV基因組DNA，一個是結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：wtAAV ITR序列的特殊性(T型結(jié)構(gòu)，見AAV基因組部分)。ssAAV包裝基因組正義鏈和反義鏈的幾率一樣。ssAAV在入核、脫衣殼后，需要借助宿主DNA聚合酶或者分子間退火完成雙鏈轉(zhuǎn)化，才能啟動基因轉(zhuǎn)錄過程，而scAAV中已存在雙鏈，它入核后即可啟動基因轉(zhuǎn)錄，跨過了雙鏈轉(zhuǎn)化的步驟，從而實現(xiàn)外源基因的快速表達。下圖是ssAAV和scAAV向靶細胞中遞送外源基因的過程。
維真生物采用的腺相關(guān)病毒/AAV包裝系統(tǒng)為改良版的腺相關(guān)病毒/AAV無輔助病毒系統(tǒng)（AAV Helper-Free System），下面是該包裝系統(tǒng)的示意圖：
腺相關(guān)病毒/AAV包裝流程
維真生物可以提供從腺相關(guān)病毒/AAV質(zhì)粒設(shè)計、構(gòu)建、包裝至表達分析的全套服務(wù)。不僅如此，維真生物也可以提供全面的腺相關(guān)病毒/AAV載體和表達系統(tǒng)，用于體內(nèi)和體外表達human/mouse/rat ORFs，lncRNA、circRNA、shRNAs和CRISPR/gRNA。維真生物生產(chǎn)的腺相關(guān)病毒/AAV具有滴度高、純度高和穩(wěn)定性高的三高優(yōu)點。下面是腺相關(guān)病毒/AAV從頭合成的流程：
腺相關(guān)病毒/AAV純化
維真生物采用碘克沙醇密度梯度超速離心法對AAV病毒進行純化。碘克沙醇是一種造影劑，已接受了臨床檢驗。它具有非離子型、對細胞無毒和代謝惰性等優(yōu)點。現(xiàn)在在病毒純化方面應(yīng)用廣泛。它利用不同顆粒之間存在的沉降系數(shù)差，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶。下圖是AAV病毒純化前后的示意圖：
腺相關(guān)病毒/AAV滴度檢測
維真生物的AAV病毒是通過用QPCR的方法來檢測的病毒滴度，得到的結(jié)果為包裝得到的病毒顆粒數(shù)。其原理是用腺相關(guān)病毒基因組特異性引物進行實時定量PCR。在定量曲線的線性范圍內(nèi)，Ct值與已知拷貝數(shù)質(zhì)粒的Ct值的比值即為病毒基因組的初始拷貝數(shù)。下面是AAV-GFP滴度的檢測結(jié)果：
腺相關(guān)病毒/AAV純度檢測
維真生物的AAV純度通過靈敏的銀染方法進行檢測。AAV衣殼蛋白含有3種亞基VP1（82kDa）、VP2（72kDa）、VP3（62kDa），且所占比例為VP1：VP2：VP3=1:1:10。因此，一個純度高的AAV在SDS-PAGE分析時僅顯示三條帶。下圖是純化后AAVs的銀染結(jié)果：
1. AAV 和重組rAAV的區(qū)別？
腺相關(guān)病毒（AAV）屬于微小病毒科，是一類小的、二十面體、無包膜病毒。1965年，AAV發(fā)現(xiàn)于腺病毒制備物中，并由此得名。AAV是一種復(fù)制缺陷性病毒，其復(fù)制依賴于其他輔助病毒，如腺病毒和皰疹病毒。AAV不編碼自己的聚合酶，因此其復(fù)制過程依賴于宿主細胞的聚合酶活性。
重組AAV（rAAV）是人工改造的AAV，沒有編碼AAV病毒復(fù)制和結(jié)構(gòu)蛋白的rep和cap基因。rAAV中與復(fù)制和包裝相關(guān)的rep和cap 基因被替換為ITRs間的基因表達框，這使rAAV具有約4.7 kb的包裝容量。
2. 使用AAV有哪些生物安全性要求 ?
可在生物安全1級（BSL-1）實驗室操作生產(chǎn)無輔助病毒和編碼非致癌基因的重組AAV。另外，應(yīng)在生物安全2級（BSL-2）實驗室封閉處理具有生物危害性的材料。
3. 重組AAV 安全嗎 ?
迄今為止，未發(fā)現(xiàn)野生型AAV有致病性。野生型AAV，在無需輔助病毒（如腺病毒）的存在下，復(fù)制效率非常低。重組腺相關(guān)病毒（rAAV）由多個質(zhì)粒（cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、rep/Cap質(zhì)粒）組成。Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒與rep/Cap質(zhì)粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有復(fù)制的能力。
4. 哪些血清型的AAV可供選擇？
目前為您提供的AAV 血清型為AAV1，AAV2，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8 &，AAV9，AAV rh10，AAV retro，AAV ANC80，AAV DJ & AAV DJ-8，AAV PhpB & AAV PhpeB，AAV 7m8和AAV shh10等。
5. 使用重組腺相關(guān)病毒rAAV遞送基因的優(yōu)勢是什么 ?
rAAV病毒滴度高，可感染分裂和非分裂細胞、免疫原性小、體內(nèi)表達外源基因時間長。
6. AAV載體穩(wěn)定嗎? 如何保存AAV載體 ?
純化的AAV載體在4℃或更低溫度下高度穩(wěn)定。建議您將AAV分裝后，-80℃下長期保存。
7. 訂制AAV服務(wù)，客戶需要提供哪些材料? 客戶收到的產(chǎn)品是怎樣的 ?
您可以從我們的人源ORF cDNA庫中挑選，或者提供您的質(zhì)粒DNA或DNA序列，我們將基因克隆至AAV載體。您還可以指定特定的融合標簽和AAV血清型。
基因沉默服務(wù)，請您提供已驗證的shRNA序列以構(gòu)建重組rAAV載體。我們的標準載體具有U6啟動子和GFP標記。
通常情況下，可為客戶提供500 ul病毒液1×10^13 VP/ml。也可根據(jù)客戶的需要，提供特定規(guī)格的產(chǎn)品。
8. 慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒三種病毒有什么區(qū)別？如何選擇？
對于轉(zhuǎn)染困難的細胞，科研工作者通常會選擇病毒來導(dǎo)入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒是常用的病毒載體工具。那么如何選擇適合您實驗體系的病毒工具，請參考下面3種病毒工具的比較：
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病毒表達系統(tǒng)
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腺病毒
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腺相關(guān)病毒
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慢病毒
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病毒基因組
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dsDNA
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ssDNA
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ssRNA
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病毒外殼
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無
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無
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具有包膜蛋白
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基因組大小
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38-39kb
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5kb
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9kb
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包裝容量
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7.5kb
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4.7kb
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6kb
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感染的細胞類型
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分裂細胞和非分裂細胞
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分裂細胞和非分裂細胞
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分裂細胞和非分裂細胞
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整合至宿主基因組
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非整合
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非整合
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整合
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表達豐度
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高水平表達
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高水平表達
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中到高水平表達
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表達時間
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快（1-2天）
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1-2周（體內(nèi)）
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慢（2-4天）
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外源基因持續(xù)表達時間
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短暫
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潛在的持久
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長久
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免疫反應(yīng)
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較高
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極低
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低
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相對病毒滴度
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10E10pfu/mL
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10E13VG/mL
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10E8TU/mL
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生物安全等級
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BSL-2
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BSL-2
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BSL-2
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